▇珀莱雅研发创新中心黄洁芳
随着全球城市化进程不断的往前推进，人们的生活环境不断被破坏，PM2.5、氮氧化物、硫氧化物、臭氧等不利因素，无时无刻不在侵害人们的皮肤，造成皮肤粗糙、敏感、角质层变厚变硬、衰老、肤色不均等肌肤问题。
在上述背景下，近年来，具有抗污染宣称的护肤品逐渐引领市场潮流，呈现较快速度发展。本文将结合各类污染因素对皮肤的破坏机制，简要概述抗污染活性成分的功效测试方法，并分别从防护、强韧、清除、修复四个方面，对抗污染护肤品的功效成分进行设计，旨在为配方开发工程师们提供一个较为全面的解决方案。
前言
近年来，随着全球工业化和城市化进程的突飞猛进，环境污染，特别是大气污染越来越严重，雾霾、臭氧、汽车尾气等，无一不在影响着人们的健康。身处都市当中，人体最大的器官——肌肤，不可避免地成为直接接触外界污染的第一道防线，面临着前所未有的压力。在空气污染的侵害下，肌肤变得粗糙、暗黄、失去弹性，皱纹也提早爬上面庞。
目前，市面上宣称具有“抗污染”功效的化妆品，大部分仅从某一方面，解决污染对皮肤造成的负面影响，无法提供较为全面的解决方案。针对上述情况，本文将结合不同污染因素对皮肤的破坏机制，简要概述相应抗污染活性成分的的功效测试方法，并从防护、强韧、清除、修复四个方面，对抗污染护肤品进行设计，旨在为配方工程师在开发抗污染护肤品时，提供一个新思路。
1.抗污染功效测试方法
1.1香烟烟雾测试
香烟烟雾分析模型（简称CES）是常用的空气污染模型。
试验步骤简述如下：先以抽真空的方式，让香烟烟雾，以三支长85mm的研究用过滤嘴香烟为载体，穿过30ml已消毒的磷酸盐缓冲液，来准备香烟烟雾溶液。
然后，将准备好的香烟烟雾溶液，放入不同浓度的人类真皮纤维原细胞（NHDF）或表皮角质化细胞（NHEK）培养皿中，进行过滤消毒。试验时将NHDF和NHEK放入香烟烟雾溶液，或含有一定浓度活性物的香烟烟雾溶液中培养。
测试结束后，可采用多种方法，对活性物的抗污染机理进行研究。
例如，可利用基因芯片分析技术，综合分析所有基因的前后变化情况；
然后，再利用RT-PCR量化分析技术，确认指定基因的前后变化情况。若活性物能够显著控制在香烟烟雾压力下，某些关键基因的表达，则说明该活性物能减少污染物对细胞的毒害作用。
也能通过对比活性物处理与否条件下，某些炎症因子的表达量差异，或细胞的不同存活情况，来判断受试物的抗污染活性。
1.2细胞存活能力测试
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在nm或nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量,在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该法可用来评判某些活性成分对尼古丁、氯等有毒化学物质的解毒作用。试验时将一定浓度活性物溶液，作用于培养于尼古丁溶液或氯溶液中的NHEK或NHDF中，一段时间后采用MTT法测细胞存活率。存活率越高表明活性物的解毒效果越好。
1.3抗炎能力测试
环境污染会引发皮肤炎症反应。已知NF-kb（转录因子）是机体炎症反应中主要的调控蛋白，控制着各种炎症蛋白因子的产生和释放。许多活性物均通过抑制NF-kb发挥抗炎的功效。
因此，为了测试某待测物质的抗炎作用，可以NF-kb为炎症标志物，用肿瘤坏死因子α（TNF-α）或白细胞介素等炎症性细胞因子刺激人角质形成细胞，激活NF-kb并诱发细胞炎症反应。
与此同时，加入一定浓度待测物质处理细胞，就可以观察其抑制NF-kb表达的能力。通过与没有加入待测物质的细胞相比较，就可以得到待测物质对细胞炎症反应的抑制百分率，同时还可以得到最大抑制百分率时的待测物浓度。
1.4金属离子螯合能力测试
可分为化学测试与体内测试两种。
化学测试的测量原理是：利用分光光度法来测量加入一定浓度活性成分后，金属离子溶液吸光度的变化，获得溶液中自由金属离子的数量，进而评估其螯合能力。
体内法则是以人类角质细胞为试验对象，将其用MTT染色法进行染色，利用FENTON反应，即铁离子（Fe2+）和过氧化氢进行反应，作用于人类角质细胞上，通过对比添加活性物与否，细胞存活能力的差异，得到活性物对铁离子的螯合能力。
1.5细胞自噬促进作用测试
自体吞噬蛋白LC3是自噬-溶酶体形成的标记物，因此蛋白质LC3是体外筛选测试自噬的关键标记物。试验时将来源于人表皮的角质形成细胞，接种96孔板，将不同浓度活性物滴入孔板培养48h，采用体外免疫荧光标记法，标记自体吞噬蛋白LC3，通过测定荧光强度判断细胞自噬活力的大小，从而得出活性物对细胞自噬的促进作用。
1.6彗星实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单、双链缺口损伤的程度。
当DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂后，在碱性电解质的作用下，损伤的DNA断链及片段被释放出来，所以在电泳过程中带负电荷的DNA，会离开核DNA向正极迁移形成“彗星”状图像。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度，就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
同样以人体角化细胞为试验对象，先用含有活性物的溶液对细胞进行培养，然后加入污染物（如苯并（a）芘）溶液，以未用活性物处理过的细胞作为对照，对比两者试验结果，从而评价活性物对DNA的保护作用。
1.7苯并（a）芘解毒测试
苯并（a）芘存在于汽车废气、香烟、厨房油烟等烟气中，是多环芳烃的代表性物质。
苯并（a）芘进入机体后，会与细胞中的芳烃受体（AhR）结合，诱导CYP1A1酶的表达，并在其代谢作用下，产生活性氧簇（ROS）和二羟环氧苯并芘（BPDE）。
其中，ROS会引发肌肤炎症，加速肌肤老化，而BPDE则会通过与DNA结合造成无法修复的DNA损伤。因此，可逆地阻止苯并（a）芘与AhR的结合，是抗污染的一条有效途径。
为了证明活性物的上述功效，可将人体角化细胞分为两组，试验组用一定浓度活性物培养，对照组不作处理，然后用苯并（a）芘溶液，处理两组细胞，采用qRT-PCR测量CYP1A1mRNA，通过对比CYP1A1表达的降低程度，评估活性物对苯并（a）芘的解毒功效。细胞内CYP1A1的水平越低，表明该活性物能有效防止苯并（a）芘与细胞内AhR结合，从而缓解苯并（a）芘的细胞毒性。
1.8皮肤净化功效测试
隔绝外界污染物对肌肤的粘附，也是防止污染物侵害肌肤的一条有效途径。
可采用人体法（invivo）对活性物抗粘附功效进行检测。
以煤为污染物模型，将受试皮肤分成三个区域。在污染物处理前，于三个受试区域分别涂抹相同量的水、安慰剂乳液与添加有一定浓度活性物的乳液，吸收完全后用煤对皮肤进行污染处理，并对各区域用成像显微镜进行半定量分析；
接着用清水清洗皮肤，待晾干后，用成像显微镜进行第二次半定量分析；
最后对受试区域进行剥离操作，以评价深度净化后，污染物对皮肤的粘附情况。通过对比三个区域的污染物残留情况，对活性物的防止污染物粘附的功效进行评价。
1.9相关蛋白质表达检测
一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶），因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志。
检测蛋白质的方法很多，除酶联免疫吸附实验（ELISA法）外，免疫印迹法（WesternBlot法）也是是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。
与前文所述机理相关的蛋白质包括：基质金属蛋白酶MMPs，水通道蛋白AQPs，透明质酸键合蛋白等。可通过对比活性物处理前后，相关蛋白的表达情况，来评价其对应功效。
2.抗污染活性物的选择
针对护肤品市场对抗污染宣称及功效的诉求，很多化妆品原料公司相继推出了各类产品。作者按防护、强韧、清除、修复这四个方面的机理，将一些典型原料进行了归类总结。
2.1防止污染粘附，保护免受损伤
大气污染物包括悬浮微粒（PM10，PM2.5）、多环芳烃（PAHs）、挥发性有机物（VOCs）、氮氧化物（NOx）、硫氧化物（SOx）、一氧化碳（CO）与臭氧（O3）等有害物质。
其中，造成雾霾的元凶——PM2.5是一类不可忽视的皮肤侵略者。
PM2.5又称细颗粒物，是指环境空气中，空气动力学当量直径小于等于2.5μm的颗粒物，它的表面积大，活性强，具有细小多孔结构，更易附带有毒、有害物质（例如PAHs、重金属、微生物等）。与较粗的大气颗粒物（PM10）相比，PM2.5在大气中的停留时间长、输送距离远，不仅影响着人们的健康，还无形中增添了皮肤的负担，成为人们北京最好白癜风医院咨询北京治疗白癜风能治好么
